Antonio Maria Ghislieri nacque il 17 gennaio 1504 a Bosco Marengo, all'epoca appartenente alla diocesi di Tortona e quindi al Ducato di Milano, da una famiglia di nobili decaduti, discendenti secondo alcuni dalla nota famiglia bolognese.

Entrato all'età di quattordici anni nell'Ordine dei Frati Predicatori (fondato da Domenico d Guzmàn nel XIII secolo con il fine di lottare contro gli eretici catari), professò i voti solenni nel 1519, per poi completare i suoi studi teologici a Bologna. Fin da quegli anni di studio, si mise in luce per la sua viva intelligenza, manifestando al tempo stesso quell'austerità che divenne nel tempo una sua caratteristica di vita.

Ordinato presbitero nel 1528, diede subito prova della solidità della sua formazione teologica e delle opinioni che avrebbero trovato realizzazione pratica nel corso del suo pontificato, sostenendo a Parma trenta proposte contro le eresie. E sempre nel quadro della sua avversione nei confronti dei movimenti bollati di eresia, chiese e ottenne di essere nominato inquisitore della città di Como.

La sua attività di inquisitore continuò anche dopo il 1550, quando tornò a Roma, dove presto assunse la carica di commissario generale dell'Inquisizione romana. Entrato nelle grazie di papa Paolo IV, nel 1556 divenne vescovo, l'anno successivo fu creato cardinale e nel 1558 venne infine nominato Grande Inquisitore.

Risale a questo periodo la distruzione delle colonie dei valdesi di Calabria, che posti di fronte all'alternativa tra l'abiura e la morte, cercarono salvezza nella fuga tra i monti. Iniziò quindi una gigantesca caccia all'uomo che si concluse, nel 1561, con la distruzione di interi villaggi, l'uccisione di 2200 uomini, donne e bambini, e la cattura di altri 1600.

Cinque anni più tardi, alla morte di Pio IV che era nel frattempo succeduto a Paolo IV, fu eletto Papa: un'elezione che fu accolta con un certo timore negli ambienti della Curia romana, visto il carattere intransigente di Pio V. Il quale infatti si batté contro il nepotismo imperante, cercando con ogni mezzo di moralizzare i costumi: punì l'accattonaggio, vietò il carnevale, cacciò da Roma le prostitute, inflisse pene severe agli adulteri e condannò a pene corporali e pecuniarie fornicatori, profanatori dei giorni festivi e bestemmiatori.

Il suo pontificato fu ispirato alla difesa ferrea e intransigente della Chiesa cattolica, culminando nel 1569 con l'emissione della Bolla papale Hebraeorum gens, con la quale sancì la chiusura di tutti i ghetti dello Stato Pontificio, ad eccezione di quelli di Roma e Ancona, e che si risolse in una vera e propria persecuzione, non solo contro gli ebrei, molti dei quali furono costretti ad abbandonare le loro case per trovare rifugio fuori dallo Stato della Chiesa, ma anche contro i cristiani di altre confessioni e verso chiunque esprimesse in qualche modo il suo dissenso.

Ne fecero le spese Elisabetta I d'Inghilterra, scomunicata, e soprattutto Niccolò Franco, autore di una pasquinata, e il poeta Aonio Paleario, entrambi condannati al rogo nel 1570. Riuscì invece a farla franca l'anonimo autore della pasquinata che accompagnò queste due esecuzioni: "Quasi che fosse inverno/ brucia cristiani Pio siccome legna/ per avvezzarsi al fuoco dell'inferno".

Preoccupato dall'avanzata turca, istituì con Genova, Venezia e la corona spagnola la Lega Santa, le cui forze riportarono la vittoria nella battaglia di Lepanto il 7 ottobre del 1571. Si narra che in quell'occasione, venuto a conoscenza dell'esito della battaglia tramite una visione, ordinasse di suonare tutte le campane di Roma a mezzogiorno, ed è da allora che le campane suonano ogni giorno alle 12. Quella vittoria tuttavia non si concretizzò, come Pio V aveva sperato, nella liberazione del Santo Sepolcro.

L'anno dopo, già sofferente di calcolosi, fu colpito da una grave ipertrofia prostatica per la quale non accettò di farsi visitare, né tanto meno curare (pare per un eccesso di pudicizia), e che lo condusse alla morte il 1° maggio del 1572.

Canonizzato da Clemente XI nel 1712, la sua memoria viene celebrata il 30 di aprile.